本文主要根据期刊文章《Mitra等（2020）Regulatory Toxicology and Pharmacology, 117 以非临床安全性评估的观点探讨治疗性多肽产品的开发》、及《Ypsilanti（2018）Health Sciences Eastern Michigan University, 有关合成肽临床前测试的法规问题》整理而成。

多肽是一类独特的药物，也是全球医药的重要治疗方法。自1920年全世界第一个多肽胰岛素被发现，其后的产品包括激素替代品（胰岛素和促肾上腺皮质激素）、天然来源分离出的抗菌素（杆菌肽，短杆菌肽D和多粘菌素B）被陆续开发出来。

从1970年代开始，合成激素类似物（莎拉欣，去氨加压素和促性腺激素）成为治疗性多肽产业的主要关注点，而如今，重组技术已用于制造激素替代品（甲状旁腺激素和胰高血糖素）和类似物（杜拉鲁肽，胰岛素类似物和 Teduglutide），可用于众多治疗领域。截至2021年已有100多种肽被批准用于人类。通常，多肽是化学合成的，是来源于细胞并由生物技术衍生的，或者是从天然产物中分离出来的，然后通过向重组产物中添加脂质结合物或通过对天然衍生产物的化学修饰。

多肽类药物涵盖众多不同种类的多肽分子，并以多种方式制造，也包括非多肽类的修饰（non-peptide modifications）。尽管多肽药物的确切定义是一个有争议的问题，但基于多肽的疗法，多肽长度的范围可以从3到100个氨基酸（amino acids,AA）。

多肽药物结构上介于小分子和蛋白质之间，具有高特异性和低毒性的独特优势。在鉴定与疾病发病机理有关的新受体和靶标方面，独特且有价值的完整的多肽全库结合高通量筛选（HTS）的技术已被成功的发展出，此技术对多肽的筛选发现苗头化合物用于治疗疾病上迈出重要的一步。

然而，某些多肽内在特性，例如代谢不稳定和需要肠胃外给药途径，是多肽药物开发及成药性的主要障碍。以上的这些障碍可以用化学合成的多肽通过使用非蛋白氨基酸（non-proteogenic amino acids）改善代谢稳定性来克服这些挑战，或者使用化学药品（例如聚乙二醇, PEG）增强穿膜运输。

此外，多肽开发的最具挑战性的阶段是临床前阶段。由于多肽不能像小分子那样通过扩散到达细胞靶标，亦不能通过细胞膜后，直接与胞内受体结合而发挥作用，因此通过体外和体内试验来确定其药理和药代动力学试验极具有挑战性。

与任何其他生物技术一样，多肽的开发和安全性评估也面临着各种复杂的挑战。其中包括在多肽疗法的开发过程中，缺乏监管法规导致了几个问题。这些问题包括但不限于–在开发化学合成的与生物技术衍生的肽时需要遵循的监管法规、毒理学实验动物模型选择的策略、遗传毒性和免疫原性评估是否具有附加价值，是否需要对含有非蛋白氨基酸的肽进行额外的毒理学研究。

因为全球缺乏针对多肽开发的具体医事注册监管法规，该类药物的非临床安全性评估只能主要依赖于将现有的小分子药物[国际协调联盟 ICH S1-S5, S7-S8, M3 (R2)]和生物制药的 [ICH S6 (R1)]医事注册监管指导法规，但是针对多肽的指导法规仍然有限。

先前的美国食品药品监督管理局(US FDA)注册法规指出，细胞培养产生的所有蛋白质和多肽产品，除抗生素和激素产品外，均应作为生物制剂进行审查。FDA CDER部门审查了当前数据集中的绝大多数肽。唯一的例外是Fc或白蛋白融合物（阿比鲁肽，杜拉鲁肽，romiplostim），阿卡仑肽，新型60AA重组激肽释放酶抑制剂和甲状旁腺激素（84 AA），因为它们被认为是激素产品。

FDA在2020年3月更改了多肽类药物的分类，当时生物制剂价格竞争和创新（BPCI) 法案正式宣布，大于40AA的重组分子，无论其药理学如何，都将被视为蛋白质生物制剂，而无论生产方法的所有小于 40 AA 多肽类，都将遵循新藥申請 (NDA) 途径。

本报告的借由1998年至2019年在美国治疗性多肽产品获得批准摘要 (Summary basis of approval, SBA) 分析，包括总共47种多肽外，有49％ 是化学合成的，有40％是通过生物技术合成的，有13％是半合成制造的，1％ 是从天然来源获得的。

为了深入了解治疗性多肽的医事注册法规要求，在治疗性多肽产品批准摘要分析下，发现其研发模式，遵循的医事注册监管法规以及毒理学实验动物模型选择的策略，其中包括：遗传毒性和免疫原性评估的要求，杂质、代谢物和安全药理学评估，含有非蛋白氨基酸（NPAA）的多肽的安全性和安全性评估。其非临床毒理学发展策略如下:

一般毒理学

根据当前ICH指导法规的措辞，化学合成和生物技术衍生的多肽似乎属于 ICH S6（R1 ）法规。但是，从获得批准治疗性多肽产品中可以清楚地看出，实际上多肽药物总是使用类似ICHM3（R2）的小分子药物方法开发的。这包括在啮齿动物和非啮齿动物物种中进行一般毒性研究，基于最大耐受剂量（MTD）设置高剂量的非临床毒理学研究 (包括之后评估遗传毒性、发育毒性和生殖毒性)，而不是考虑效价、结合亲和力、靶标结合和/或受体占有率 (RO）。

虽然ICH M3（R2）医事注册指导法规明确指出治疗性多肽产品在本法规的范围之外，而ICH S6（R1）指导法规建议在该法规的原则下开发化学合成或重组的多肽药物。但是，获得批准治疗性多肽产品不管采用何种多肽合成方法，大多数均按照ICH M3（R2）指导法规，在所有肽的啮齿动物 (大鼠) 和非啮齿类动物 （狗或食蟹猴）中进行了常规毒理学研究，在研究中探索并提供的最高剂量是基于最大耐受剂量或极限剂量。

通常，慢性毒理学研究的持续时间遵循ICH S4的指导。啮齿类动物研究通常持续时间为≥6个月，同样的非啮齿类动物研究也持续时间为≥9个月，若急性或较短的临床给药方案可以选用持续时间较短的慢性毒理学研究。

发育和生殖毒理学 (DART)

由于治疗性多肽药物可作为激素的类似物或拮抗剂，加上激素在许多情况下是生殖发展和胎儿发育过程所必需的，因此发育和生殖毒理学研究被认为对治疗性多肽药物的安全评估是事关重要的。所以针对所有治疗性多肽药物应该进行了 Seg I 啮齿动物的生殖毒理研究，Seg II 啮齿动物和兔子的胚胎-胎儿发育的生殖毒理研究以及Seg III 啮齿动物的产前和产后发育的生殖毒理研究。

此外，生殖毒理学还对治疗性多肽药物进行了幼体毒性研究。根据 ICH S6（R1）注册指导法规，生物制药要求在非人类灵长类 (NHP) 动物中进行主要生殖毒理学研究。但是在获得批准重组多肽药物注册审批过程中发现，在生殖毒理学实验上，医事注册监管机构尚无对多肽药物药理学相关实验动物模型的选择做进一步的讨论。

多肽药物含有非蛋白氨基酸

非蛋白氨基酸可以是天然存在（例如肌氨酸，鸟氨酸或D-丙氨酸），也可以是非天然存在（例如1-萘基丙氨酸，4-氯-D-苯丙氨酸或苄基酪氨酸）。在多肽药物中，为了改善多肽对靶标结合亲和力或稳定性，非蛋白氨基酸通常加入多肽中。

在1998年后获得批准的47种多肽药物中，有45％至少包含一种非蛋白氨基酸，其中有17％至少包含一种非天然的非蛋白氨基酸，而且这些多肽制剂大多数具有包含一个以上的非蛋白氨基酸。

从理论上讲，该多肽一旦被代谢就可以释放出非蛋白氨基酸，然后可以将其掺入体内的内源性蛋白质中。当非蛋白氨基酸存在于肽治疗剂的结构中时，即使这些非蛋白氨基酸没有使用先例，医事注册监管机构也未要求进行其他毒理学研究。唯一的例外是非蛋白氨基酸也以杂质形式存在于原料药或药品中。

所以对于绝大多数的（天然或非天然）非蛋白氨基酸，即使在以前批准的多肽药物在从未使用过非蛋白氨基酸的情况下，极为罕见对于独立的非蛋白氨基酸进行专门的遗传或一般毒理学研究。

在两个获得批准多肽药物中，医事注册监管机构要求申办方的对联氨苯吡啶多肽药物 (bivaluridine) 必须在大鼠中进行了急性和重复剂量毒性研究，因为其中有2种非蛋白氨基酸原料药（DS）以的杂质形式存在。

对于依卡替班多肽药物 (icatibant)，在2种非蛋白氨基酸原料药中发现杂质情况下，医事注册监管机构要求申办方进行了单剂量体内毒理学研究和遗传毒理学研究 (细菌反向突变试, Ames test)。

免疫原性 (ADA) 评估

化学合成和重组的多肽治疗剂，就像蛋白质一样，具有诱导人类免疫原性应答的潜力。如果多肽药物基于任何内源性蛋白质中都不存在的 AA 序列的话，则抗药物抗体 （ADA） 的产生会导致功效丧失和清除率改变。在大多数情况下，这将意味着增加剂量水平或改用其他药物。

但是，当多肽药物是内源蛋白质的类似物或与内源蛋白质的序列有明显重叠时， ADA 抗体的产生可能意味着针对此类内源蛋白质的抗体，若这一个问题存在的话，这将是一个重大的安全问题。

在 1998 年后获得批准多肽药物中，有 67％ 多肽药物在非临床或临床研究中有评估ADA。评估了免疫原性的多肽药物中，在非临床、临床研究中分别有 62％、87％ 的 ADA 呈阳性，但非临床 ADA 测试在预测临床 ADA 阳性结果敏感度的仅为 72％。

在过去的十年中， ADA 测定的灵敏度以及在血清中存在过量药物的情况下测量 ADA 的方法已有所改善，因此， 2007 年后几乎测试的每种多肽药物的 ADA 都成呈阳性反应。产生 ADA 的多肽药物氨基酸长度范围为 8 到 84。

另外，在临床上具有 ADA 阳性的多肽药物中，大多数 （66％） 不包含非蛋白氨基酸。这表明多肽药物的氨基酸长度和非蛋白氨基酸的存在均未对其免疫原性产生明显影响。在临床上对 ADA 测试呈阳性的药物中，有 90％ 的病例没有对药物的药代动力学 （PK） 或对药效产生影响。

尽管尚未建立 ADA 测试在非临床物种中与临床反应的相关性，但在药物显示非临床 ADA 呈阳性的所有情况下，它在临床中也大都会呈 ADA 阳性。在临床上对 ADA 进行非临床评估的药物中，有 72％ 的抗药物抗体阳性，而在临床中 87％ 的 ADA 药物呈阳性，这表明肽类药物产生抗体的倾向很高。

但是，在临床上已观察到 ADA 阳性反应的90％的病例中，未观察到对 PK 或功效的影响，即使在 ADA 影响药效学读数的两种情况下，在临床试验中也仅占受试者的一小部分，这似乎并不是一个重大的安全隐患。但仍建议在多肽药物的开发使用相关且灵敏的检测方法来监控 ADA 的形成。

杂质鉴定

根据现有医事注册监管指导法规，多肽药物质量检查标准是依据在小分子药物 [ICH Q3A (R2) 和ICH Q3B (R2)] 指导法规、或依据生物制药指导法规 （ICH Q6B）有关原料药及药物中杂质和降解物的标准，尚未定论。

多肽药物申办方对化学和半合成生产的 57％ 多肽中进行了独立的杂质和降解物鉴定研究。其中包括体外遗传毒性试验以及使用“加标”或降解批次的一般毒性研究。

对于依卡替班多肽药物，申办方被要求按照基于多肽杂质的鉴定和鉴定阈值进行 3 个月的杂质鉴定研究，而不是 ICH 杂质鉴定指南文件中提到的传统阈值。所以，建议未来多肽重组药物可能需要降解物鉴定研究。例如，对于胰岛素地高卢德和德特米尔胰岛素，对此类型的多肽药物进行了为期 1 个月的大鼠降解资格研究。

因为缺乏关于多肽药物杂质的明确指导法规，并且在 ICH Q3A（R2）法规特别标明多肽类不在管辖范围之内。尽管与多肽药物工艺有关的小分子杂质，可能存在于合成或半合成肽中，但这些杂质通常可以通过现代制造技术轻松控制。

相比之下，在多肽合成过程产生的多肽相关的杂质更是一个问题，由于它们与药物本身结构相似，以及与传统的小分子相比较大的，相对复杂的肽分子结构，所以这些与多肽的杂质难以检测、定量和控制。

重组肽可以使用类似 ICH Q6B 指导法规的方法将这些杂质作为产物异质性处理，但是化学合成的肽很可能包含相似的异质性，同时仍保留了传统的以小分子为重点的杂质指导原则。在这种情况下，需要采取更加细致和灵活的方法来处理多肽药物的杂质问题。

生物转化和药代动力学评估

对所有化学合成和半合成多肽药物进行了详细的生物转化研究，这些研究包括多肽药物体外代谢和活性的研究、代谢物的结构表征以及体内代谢动力学和毒理学研究中代谢物的定量研究。其中仅对几种重组多肽药物采用了甘精胰岛素和甘精胰岛素的放射性标记多肽，进行非临床体内代谢物分析。

此外，这些人类多肽代谢物水平皆低于在非临床实验动物的水平，所以没有进行任何多肽独立的代谢物安全性评估研究。并且 ICH S6（R1） 法规特别指出，生物技术来源的药物会降解为小肽和单个 AA，因此，其代谢途径都充分被理解，因此认为其生物转化研究不是必需的。

除了一个例外情况 ，若多肽主要代谢物会影响到药理反应，建议执行非临床和临床研究中对其进行主要代谢物的定量分析，以了解其对药物药理学的影响。

遗传毒性评估

根据 ICH S6（R1） 法规，重组产品无需进行基因毒性评估，因为重组产品不会直接与 DNA 或其他染色体材料发生相互作用。但是在 1998 年后获得批准多肽药物中，对所有化学合成、半合成衍生和天然多肽药物进行了完整标准遗传毒性评估（包括体外细菌 Ames 以及体内和体外染色体畸变测试）。

因此，对于为什么对重组多肽药物进行遗传毒性评估，原因尚不清楚。在获得批准的多肽药物中，无论用何种方法合成的多肽药物，都对大多数多肽（包括重组肽）进行了遗传毒性评估，最终的结果判定为没有遗传毒性。

另一种可能的情况是，当使用 Ames 分析法来评估化学合成或半合成多肽药物时，因为多肽合成过程所产生的杂质可能会产生潜在的遗传毒理反应。

光毒性评估

多肽药物的光毒性评估是使用在 3T3 中性红吸收试验，对多肽进行光毒性潜能的体外评估。但是，欧洲医学协会实验指出多肽药物具有一些紫外线吸收的趋势（通常在 280 nm处出现峰，在 290 nm 处出现肩峰）。

因为多肽中的芳香族氨基酸可作为生色团。这与任何光毒性无关，并且通常不需要对多肽药物进行光安全性测试。此外，根据 ICH S10法规，多肽药物不在法规适用的范围。因此，不建议多肽药物治疗剂进行光毒性评估。

安全药理学

在ICH S6（R1）和ICH S7A＆B法规中提供了有关生物制剂和小分子药物的具体指南。但是多肽药物的在安全药理试验的评估中，没有具体法规规定多肽药物必须进行 hERG 抑制作用测试和进行全面QT评估。

在1998 年后获得批准的多肽药物中，发现NDA中提交的49％多肽药物执行 hERG 分析评估，于2005年在ICH S7B法规发布后，所提交的69％获得批准的多肽药物中，包含特定的 hERG分析。当前不建议对在生物許可證申請 (BLA) 下提交的多肽药物进行 hERG分析。

有趣的是，作为BLA提交的67％的多肽药物，在其数据包中包含了hERG分析。在心血管安全药理研究中，无论以 NDA 还是 BLA 形式提交的多肽药物，所提交的40％获得批准的多肽药物中，使用大鼠、狗或非人类灵长类动物进行的心血管安全药理研究。

但多肽药物中只有不到一半是在临床全面 QT 研究中进行评估的，尚不清楚采用什么标准来纳入或省略这些研究。目前为止已批准的多肽药物中，尚未发现具有确定的 QT 间隔延长的多肽药物。

致癌性评估

根据ICH S1法规，致癌性评估必要在两种非临床啮齿动物模型中进行多肽药物试验。使用了15％和35％获得批准的多肽药物在一种和两种啮齿动物中分别进行了致癌性研究，由于所有多肽药物均不具有遗传毒性，观察到约 50％ 的致癌性可能是啮齿动物模型中药理夸大的结果。由于多肽药物本质上是没有遗传毒性，因此，建议在进行致癌性研究之前，应先测试啮齿动物中多肽的药理活性，并与医事注册监管单位进行充分沟通。

总之，本写意报告旨在介绍多肽药物非临床安全性测试相关的医事注册监管单位意见，并强调多肽类药物监管方式的主要差异，以及提供其发展所需的毒理学、安全药理学和免疫原性评估的期望。

在多肽治疗药物的开发方面存在很大的歧义，此报告的分析为多肽治疗药物的非临床开发提供了一个通用框架，并突显了医事注册监管单位需要针对多肽治疗药物在遗传毒性、杂质、代谢产物和非蛋白氨基酸评估等方面建立特殊法规。

本报告的另外一个目的是分析获得批准的多肽类药物的非临床毒理学发展范例，提供资讯给中国多肽药企在美国注册治疗性多肽产品的公认法规要求，以期了解用于支持其多肽类药物在美国注册的研究和策略的制定。

此文引自于：同写意